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RSS/FEED訂閱Science Advances I 首次建立非洲豬瘟病毒感染性克隆平台
近日，美國 J.Craig Venter Institute（克雷格·文特爾研究所）Sanjay Vashee 研究員成果以「A synthetic genomics-based African swine fever virus engineering platform（基於合成基因組學的非洲豬瘟病毒工程平台）」為題在 Science Advances（Q1 IF:11.7） 發表。
非洲豬瘟（ASF）是家豬的一種致命性病毒性疾病，對全球養豬業有著巨大的經濟影響。它存在於非洲、歐洲、亞洲以及加勒比海的伊斯帕尼奧拉島。目前沒有有效的治療方法，也沒有廣泛獲批許可的疫苗【小編推薦:顯微鏡學家發表對四家疫苗公司的成分分析】來預防這種疾病。由於缺乏方便的工具來對其病原體非洲豬瘟病毒（ASFV）進行基因改造，抗擊非洲豬瘟的努力受到了阻礙，這在很大程度上是因為其龐大的非感染性基因組。本研究中作者報告了利用合成基因組學方法，藉助一種由 CRISPR-Cas9 抑制的自輔助病毒，開發出一種針對非洲豬瘟病毒的反向遺傳學系統，以便從合成基因組中重建有活性的重組非洲豬瘟病毒，從而快速產生各種非洲豬瘟病毒的組合突變體。該方法將極大地促進針對非洲豬瘟的治療方法、亞單位疫苗和減毒活疫苗的開發。
作者基於之前的研究提出了一個假設：一種其複製能被某種機制（如宿主細胞中的 Cas9 切割）有效抑制的非洲豬瘟病毒株，應該可以作為一種自輔助病毒，用於包裝或 「啟動」 對該抑制機制具有抗性的非洲豬瘟病毒株的病毒粒子 DNA，從而實現病毒的重建。這個想法類似於 20 世紀 60 年代和 70 年代初期使用條件致死的 「輔助」 噬菌體來轉染分離出的野生型 DNA 的方法。
因此，為了驗證這一假設，作者選擇了兩株重組非洲豬瘟病毒株，ASFV-ArmeniaΔ285L::GFPhuCD4 和 ASFV-NHVΔTK::GFP，這兩株病毒都表達綠色熒光蛋白（GFP），並且會因 p30 基因被 Cas9 切割而受到抑制，將它們作為自輔助病毒，同時選擇 ΔCD2v::DsRed 作為用於病毒重建的供體基因組。在將 ΔCD2v::DsRed 基因組轉染到正常的 WSL 細胞中，隨後用 ASFV-ArmeniaΔ285L::GFPhuCD4 或 ASFV-NHVΔTK::GFP 感染后，觀察到的主要是發綠色熒光的病灶，只有少數發紅色熒光或雙熒光的病灶。
作者使用空斑大小和在 WSL 細胞上的生長動力學測定對重建的 ΔCD2v::DsRed (D) 進行了表徵。正如預期的那樣，它表現出與親本 ΔCD2v::DsRed (V) 相似的空斑大小。此外，ΔCD2v::DsRed (D) 的複製動力學與親本 ΔCD2v::DsRed (V) 幾乎相同。這些結果驗證了作者的假設，即自輔助病毒可用於從轉染的非感染性基因組中重建病毒。
在成功開發出用於病毒重建的自輔助病毒啟動方法后，作者隨後建立了一個合成基因組學的基因組組裝過程來組裝非洲豬瘟病毒基因組，這類似於作者先前報道的用於人類皰疹病毒的方法。作者通過酵母中的轉化相關重組（TAR）技術，從 12 個重疊的野生型或修飾片段（或 「部分」）中組裝出了全長的非洲豬瘟病毒 Kenya-IX-1033 「合成」 基因組。
為了完善非洲豬瘟病毒的反向遺傳學系統，作者試圖使用自輔助病毒（見上文）從組裝好的合成非洲豬瘟病毒基因組中重建活病毒。鑒於之前使用紅色熒光的非洲豬瘟病毒 CD2v 突變體基因組進行了相關驗證，作者組裝了一個類似的全長合成基因組，其中整個 CD2v 基因被 mCherry 替換（ΔCD2v::mCh）。
為了克服人工基因組末端帶來的問題，作者又嘗試使用同源的 Kenya-IX-1033 病毒本身作為輔助病毒，從合成組裝的基因組中重建病毒，這將允許通過同源重組修復有缺陷的人工末端。
在從合成組裝的基因組中成功重建出具有類似野生型生長特性的病毒后，作者隨後試圖證明這種合成基因組學反向遺傳學系統在以組合式、全基因組方式對非洲豬瘟病毒進行工程改造方面的實用性。為此，作者分別和組合地靶向 A238L、K145R 和 I329L 基因進行缺失並獲得了這些活病毒。此外，作者還構建了含有 mCherry 與 CD2v 的 C 端融合體（CD2v-mCh/p12M）或天藍色熒光蛋白（Cerulean）與 K145R 的融合體（K145R-Cer/p12M）重組病毒，因它們可用於活細胞成像，輔助在感染過程中進行功能表徵。
總之，本研究報告了一種由創新的自輔助病毒方法介導的非洲豬瘟病毒合成基因組學反向遺傳學系統的開發。非洲豬瘟病毒反向遺傳學系統被用於生成組合式多基因缺失的 IX 型基因型毒株，以及病毒基因產物與熒光蛋白融合的有活性毒株，以促進疫苗的開發，或者更好地理解非洲豬瘟病毒的生物學特性和致病機制。
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